1、样品厚度的影响 当进行相差观察时，样品的厚度应该为5μm或者更薄，当采用较厚的样品时，样品的上层是很清楚的，深层则会模糊不清并且会产生相位移干扰及光的散射干扰。
2、盖玻片和载玻片的影响 样品一定要盖上盖上盖玻片，否则环状光阑的亮环和相板的暗环很难重合。相差观察对载玻片和盖玻片的玻璃质量也有较高的要求，当有划痕，厚薄不均或凹凸不平时会产生亮环歪斜及相位干扰。另外玻片过厚或过薄时会使环状光阑亮环变大或变小。
3、晕轮和渐暗效应 在相差显微镜成象过程中，某一结构由于相位的延迟而变暗时，并不是光的损失，而是光在象平面上重新分配的结果。因此在黑暗区域明显消失的光会在较暗物体的周围出现一个明亮的晕轮。这是相差显微镜的缺点，它妨碍了精细结构的观察，当环状光阑很窄时晕轮现象更为严重。相差显微镜的另一个现象是渐暗效应，指相差观察相位延迟相同的较大区域时，该区域边缘会出现反差下降。
4、相位倒转 当n’<n或n’>n时得到象的明暗反差正好相反，称为相位倒转。当相位差δ=0时是无法识别的，随着δ的增大反差变大，当δ继续增大到某一值后会出现相位倒转。用90%高吸光值（高反差）物镜时，这个转变值约为0.55λ，用70%标准吸光值的物镜时约为0.33λ。较高吸光值的物镜应该用于分辨较小的光程差。
